【摘要】本研究的目的是建立一種基于臨床移植需要的分離、培養(yǎng)、鑒定人骨髓間充質干細胞（mesenchymalstemcells，MSC）的方法，為配合造血干細胞移植的臨床應用提供實驗基礎。采用Percoll分離液（1.073g/ml）從新鮮成人骨髓穿刺液中分離MSC，應用貼壁篩選法傳代培養(yǎng)，流式細胞儀檢測細胞表面抗原，成骨誘導體系（地塞米松0.1μmol/L、β-甘油磷酸鈉10mmol/L、抗壞血酸磷酸鹽50μmol/L）及脂肪誘導體系（地塞米松1μmol/L、牛胰島素5mg/L、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤0.5mmol/L、消炎痛60μmol/L）分別誘導MSC定向分化，通過細胞形態(tài)觀察及免疫化學染色進行鑒定。結果表明：從成人骨髓液中分離培養(yǎng)出MSC，穩(wěn)定表達CD73、CD105、CD166，不表達CD34、CD45.定向誘導的成骨細胞表達堿性磷酸酶活性，脂肪細胞內出現(xiàn)明顯的脂滴。結論：采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法并通過流式細胞術檢測及定向誘導分化，能夠從成人骨髓液中分離出MSC，并完成細胞表型及多向分化潛能的初步鑒定。本操作方案具有一定的臨床應用價值。

　　【關鍵詞】間充質干細胞

　　間充質干細胞（mesenchymalstemcell，MSC）是最早自骨髓中分離出的一類具有自我更新及多向分化潛能的組織干細胞［1］。作為多種骨髓基質細胞的祖細胞，MSC具有穩(wěn)定和修復造血微環(huán)境，促進造血干細胞增殖、分化，調節(jié)淋巴細胞免疫功能，減輕移植排斥反應等生物學效應［2］。MSC的發(fā)現(xiàn)為針對性解決造血干細胞移植，尤其是臍血移植中的干細胞數(shù)量相對不足及減少移植物抗宿主病提供了一個有效途徑［3，4］。本研究旨在建立一種從成人骨髓組織中分離、培養(yǎng)、擴增MSC的簡便易行的方法，通過流式細胞儀檢測細胞表面抗原和定向誘導分化，完成對獲得細胞的初步鑒定，為干細胞移植的臨床治療及組織損傷修復工程提供實驗基礎。

　　材料和方法

　　材料與試劑骨髓穿刺液5ml取自于健康成人移植供者，肝素抗凝，4℃保存。分離培養(yǎng)試劑：Percoll細胞分離液（1.073g/ml，Pharmacia產(chǎn)品），MSC專用培養(yǎng)基MesenCultTM（MSCbasalmediumandmesenchymalstemcellstimulatorysupplements，Stemcell產(chǎn)品）和胎牛血清（FBS，Stemcell產(chǎn)品），低糖及高糖DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco′smodifiedEaglemedium，GibcoBRL產(chǎn)品），胰蛋白酶（Sigma產(chǎn)品）；誘導試劑：地塞米松（dexamethasone）、β-甘油磷酸鈉（β-glycerol-2-phosphatedisodiumsalt）、抗壞血酸磷酸鹽（ascorbicacid-2-phosphatesalt）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、胰島素（insulin）、消炎痛（indomethacin）及堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒均為Sigma產(chǎn)品；流式相關抗體：鼠抗人單克隆抗體CD45-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD166-PE（BDPharMigen產(chǎn)品）、CD105-FITC（SEROTEC產(chǎn)品）。主要儀器：細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶（Corning）；超凈工作臺（廣州醫(yī)學生物工程研究所，GX-Ⅱ型），細胞培養(yǎng)箱（WTCbinder），流式細胞儀（FACSCalibur，BectonDickinson產(chǎn)品），倒置顯微鏡、照相機（Olympus），熒光顯微鏡、數(shù)碼相機（Nikon），低溫冷凍離心機（IECcentra）。醫(yī)學教育網(wǎng)搜集整理

　　方法人骨髓MSC的分離培養(yǎng)與傳代無菌條件下用等量PBS稀釋肝素抗凝骨髓液，在10ml消毒離心管中加入6mlPercoll分離液，再將4ml稀釋的骨髓液小心加至分離液表面，820×g離心20分鐘；吸取分界面的白色絮狀細胞層，用低糖DMEM培養(yǎng)基混勻，300×g離心10分鐘，洗滌2次。按2×105/cm2密度接種于含MSC專用培養(yǎng)基的75cm2培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱全濕條件下培養(yǎng)48小時，全量換液，去除血細胞及其它未貼壁成分。用含10％FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況，每3天全量換液。細胞融合達80％以上，加入0.10%-0.15%胰蛋白酶-EDTA溶液2.5ml消化，按1∶4或1∶5傳代。取3代以上的細胞進行實驗。

　　MSC表面抗原的檢測取第3代生長達80%融合的貼壁細胞，用胰蛋白酶消化，計數(shù)后取2×106個細胞，分裝6管，每管加入10μl熒光標記抗體CD45-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD105-FITC、CD166-PE，另設1管為空白對照，室溫避光30分鐘；用PBS反復洗2-3次，減少非特異性結合；加入200μlPBS混勻細胞，并以1%多聚甲醛固定，4℃保存，24小時內上流式細胞儀檢測。

　　定向誘導MSC向成骨細胞分化的方法與鑒定收集消化后細胞，按3000cells/cm2接種于6孔板或24孔板，待多數(shù)細胞貼壁后，換用含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，加入成骨誘導體系：地塞米松0.1μmol/L、β-甘油磷酸鈉10mmol/L、抗壞血酸磷酸鹽50μmol/L，每3天全量換液，維持2-3周。用堿性磷酸酶試劑盒染色。

　　定向誘導MSC向脂肪細胞分化的方法與鑒定收集消化后細胞，按1×104cells/cm2接種于6孔板或24孔板，待多數(shù)細胞貼壁后，換用含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，加入脂肪誘導體系：地塞米松1μmol/L、牛胰島素5mg/L（或10mg/L）、IBMX0.5mmol/L、消炎痛60μmol/L（或200μmol/L），每3天全量換液，維持2周。鏡下觀察細胞內脂肪小滴形成情況，油紅O染色。隨機選擇10個非重復視野，計數(shù)脂肪細胞陽性率，結果用均數(shù)±標準差（X±D）表示。

　　結果

　　形態(tài)學觀察Percoll分離液分離獲得的細胞呈圓形，接種48小時全量換液后，可見少量長梭形貼壁細胞，周圍有明亮的圓形細胞存在。隨著培養(yǎng)時間延長，貼壁細胞迅速增多，呈漩渦狀生長，細胞變得細長而有突起，其間散在分布的細小黑色顆?？赡転檎掣叫詮姷难毎?，胰蛋白酶消化傳代后逐漸消失。原代培養(yǎng)的MSC約15天長滿，傳代后約5-7天可達80％融合。連續(xù)培養(yǎng)12代，細胞生長情況無明顯差異，但繼續(xù)培養(yǎng)至15代，細胞生長速度明顯減慢，細胞變大，形狀不規(guī)則，胞內顆粒增多。

　　流式細胞儀表型分析獲得的MSC均質性好，高表達間質細胞標記CD73（98.6％）、CD105（97.7％）、CD166（97.4％），不表達造血細胞標記CD45（0.2％）、CD34（0.4％）。

　　ALP染色加入成骨誘導體系后約1周，可見細胞基質出現(xiàn)結節(jié)樣鈣沉積，至2-3周明顯增多，堿性磷酸酶染色強陽性；對照組細胞以未加誘導劑的含10％FBS的高糖-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，染色呈陰性。

　　油紅染色加入脂肪誘導體系后約2-3天，個別細胞內就出現(xiàn)微小明亮的脂肪滴，聚集在細胞一側。隨著誘導時間延長，出現(xiàn)脂滴的細胞增多，脂滴明顯增大并發(fā)生融合，細胞也變成方形或角形，體積變大。培養(yǎng)至2周，融合的脂肪滴幾乎充滿整個細胞，油紅染色呈明亮的橙紅色。采用5mg/L胰島素和60μmol/L消炎痛誘導，出現(xiàn)脂滴的時間早于10mg/L胰島素和200μmol/L消炎痛誘導，脂肪細胞陽性率（90.5%±4.5%）大于后者（70.5%±5.5%）。

　　討論

　　本研究中從新鮮人骨髓穿刺液中分離獲得的骨髓基質細胞具有MSC的一般生物學特性：細胞為典型的成纖維細胞樣，呈漩渦狀貼壁生長，體外擴增至12代，細胞形態(tài)不發(fā)生明顯改變，高表達間質細胞標記CD73（SH3，4）、CD105（SH2）、CD166，不表達造血細胞標記CD34、CD45。在適宜的誘導條件下，MSC能夠較為容易地分化為成骨細胞及脂肪細胞，且具有多向分化能力。由此，建立了從新鮮成人骨髓液分離培養(yǎng)、初步鑒定MSC的實驗方案。

　　MSC在骨髓有核細胞中含量相對稀少，約為1/105［5］，隨著年齡增長，骨髓中MSC的數(shù)量及增殖分化能力均顯著下降［6］。成人骨髓中還存在著造血細胞、成纖維細胞、脂肪細胞等多種細胞成分，因此，必須找到合適的分離方法以獲得純度較高且數(shù)量較多的細胞產(chǎn)品，以滿足臨床需要。目前較為常用的方法有：根據(jù)MSC低密度特性采用密度梯度離心法；利用MSC與培養(yǎng)底物的粘附性采用貼壁篩選法；根據(jù)細胞大小和表面標記采用免疫磁珠或流式細胞分選法。貼壁法直接接種骨髓細胞，在培養(yǎng)過程中不斷換液，去除非貼壁細胞，最終得到富集的MSC，但純度較低；分選法得到的MSC純度較高，但細胞活率受影響，而且費用昂貴。采用1.073g/mlPercoll分離液進行密度梯度離心并結合定期全量換液的貼壁篩選法，培養(yǎng)出的MSC純度提高。細胞接種和傳代密度對細胞的生長速度和分化狀態(tài)有一定影響，尤其是原代培養(yǎng)的人體細胞。本實驗采用2×105/cm2的密度接種細胞，48小時全量換液。傳代時按照1∶4或1∶5擴增，細胞密度沒有嚴格限制，消化時將0.25％的胰蛋白酶稀釋為0.10％-0.15％，并盡量縮短作用時間，減少對細胞的刺激。這樣處理的細胞生長良好，多次傳代不會影響生物學特性。

　　體外研究發(fā)現(xiàn)，MSC具有多能分化的潛能，經(jīng)誘導可分化為不同的結締組織細胞，并把這一現(xiàn)象作為判斷MSC自我更新和多向分化能力的指標之一。利用MSC易于分離擴增、表型穩(wěn)定的生物學特性，可將其作為研究多能干細胞定向分化調控機制的理想模型。已發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員ERK、JNK、p38的特異性抑制劑能夠增強脂肪生成轉錄因子C/EBPα、β及過氧化物酶體增殖物活化受體（PPAR-γ）的表達，促進MSC向脂肪分化，同時抑制成骨分化［7］；骨髓基質祖細胞在向成骨和脂肪細胞分化之間存在某種平衡，ERK可能是體內決定MSC分化方向的開關［8］。本實驗聯(lián)合應用地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸磷酸鹽、胰島素、消炎痛、IBMX，誘導人骨髓MSC向成骨細胞及脂肪細胞分化。β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸磷酸鹽可為成骨細胞的形成提供磷元素，并促進鈣鹽沉積；地塞米松激活糖皮質激素受體，促進C/EBPs生成，同時降低脂肪細胞分化抑制因子pref-1的表達；胰島素與IGF-1、IRS等受體結合，激活Akt，Ras，ERK1/ERK2等信號傳導通路；消炎痛為非類固醇抗炎劑，是PPAR-γ的配體；IBMX提高細胞內cAMP水平，激活cAMP反應元件結合蛋白（CREB），調控C/EBP（的表達，誘導PPAR-γ和C/EBPα產(chǎn)生，參與脂肪細胞的早期生成［9，10］。結果還顯示，低劑量胰島素和消炎痛誘導MSC分化為脂肪細胞的陽性率更高，提示這兩種藥物在高濃度時可能存在一定的拮抗效應，胰島素促進ERK的活化可能導致PPAR-γ磷酸化而降低其轉錄活性，部分抵消了消炎痛的作用，但該結果有待重復實驗加以證實。醫(yī)學教育網(wǎng)搜集整理

　　骨髓中存在著造血組織和非造血組織兩種成分，機體內正常造血功能的維持依賴于造血干細胞的自我更新和造血微環(huán)境的完整與穩(wěn)定。MSC作為多種骨髓基質細胞的前體細胞，參與造血微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)調控，并為機體新陳代謝及組織損傷修復提供“庫存”細胞，在干細胞移植和組織工程中具有廣泛的應用前景。本研究初步建立了從成人骨髓穿刺液中獲得和鑒定MSC的實驗方案，具有操作簡單、便于掌握、實驗周期較短等特點，適于在臨床實驗室推廣應用，為今后MSC更好地進行臨床治療打下基礎。

　　參考文獻

　　1　Caplan AI. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res，1991； 9： 641-650

　　2　Devine SM，Hoffman R. Role of mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell transplantation. Curr Opin Hematol，2000； 7： 358-363

　　3　Maitra B，Szekely E，Gjini K，et al. Human mesenchymal stem cells support unrelated donor hematopoietic stem cells and suppress T-cell activation. Bone Marrow Transplant，2004； 33： 597-604

　　4　Le-Blanc K，Rasmusson I，Sundberg B，et al. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. Lancet，2004； 363（9419）： 1439-1441

　　5　Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al. Multilineage potential of adult human Mesenchymal stem cells. Science，1999； 284（5411）： 143-147

　　6　Rao MS，Mattson MP. Stem cells and aging： expanding the possibilities. Mech Ageing Dev，2001； 122： 713-734

　　7　Tominaga S，Yamaguchi T，Takahashi S，et al. Negative regulation of adipogenesis from human mesenchymal stem cells by Jun N-terminal kinase. Biochem Biophys Res Commun，2005； 326： 499-504

　　8　Jaiswal RK，Jaiswal N，Bruder SP，et al. Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated by mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem，2000； 275： 9645-9652

　　9　Nuttall ME，Gimble JM. Controlling the balance between osteoblastogenesis and adipogenesis and the consequent therapeutic implications. Curr Opin Pharmacol，2004； 4： 290-294

　　10　Rosen ED，Walkey CJ，Puigserver P，et al. Transcriptional regulation of adipogenesis.Genes Dev，2000；14：1293-1307