【關鍵詞】  分枝桿菌，結核；Rv2389；基因表達

　　Construction and expression of eukaryotic  expression vector of Mycobacterium tuberculosis Rv2389

　　XUE Ying，  BAI YinLan， GAO Hui， WANG LiMei， XU ZhiKai

　　Department of Microbiology， School of Basic Medicine， Fourth Military Medical University， Xian 710033， China

　　【Abstract】AIM：  To construct the eukaryotic expression vector encoding Mycobacterium tuberculosis Rv2389 and express it in CHO cells. METHODS： The gene encoding Rv2389 protein were amplified by polymerase chain reaction（PCR）from genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain. After sequenced， Rv2389 gene segments were  subcloned into eukaryotic expression vector pCDNA3.1（-）。 The recombinant plasmid pCDNARv2389 were transfected into CHO cells with liposome. The expressions of mRNA and protein encoded by this gene were detected respectively with RTPCR  and  indirect immunofluoresent technology. RESULTS： Rv2389 was cloned into pCDNA3.1（-） correctly， and its expression at mRNA and protein levels was detected in CHO cells. CONCLUSION： Recombinant eukaryotic plasmid encoding Rv2389 was constructed successfully. The experiment established the basis for further study on the function of Rv2389.

　　【Keywords】 mycobacterium tuberculosis； Rv2389； gene expression

　　【摘要】目的：構建結核分枝桿菌Rv2389基因真核表達載體。 方法：PCR擴增Rv2389基因，測序正確后克隆入真核表達載體pCDNA3.1（-），重組質粒酶切鑒定正確后以陽離子聚合物轉染CHO細胞后， 分別以RTPCR方法檢測mRNA表達和間接免疫熒光技術檢測目的蛋白的表達。 結果：構建了重組質粒pCDNA Rv2389， RTPCR結果證明Rv2389可在CHO細胞中轉錄，間接免疫熒光檢測證明，表達有Rv2389蛋白的細胞著染。 結論：成功構建了結核分枝桿菌Rv2389基因的真核表達載體pCDNARv2389，Rv2389基因可以在CHO細胞中表達。

　　【關鍵詞】 分枝桿菌，結核；Rv2389；基因表達

　　0引言

　　結核病是目前危害全球人類健康的重要傳染病。 這主要是因為① 卡介苗（BCG）對成年人結核病的預防效果不穩(wěn)定，保護力為0%~70%；② 沒有特異性的診斷試劑；③ 艾滋病等免疫缺陷個體的出現(xiàn)加快了本病的嚴重后果；④ 耐藥菌株的大量出現(xiàn)［1］。 因而尋找更有效的替代卡介苗的疫苗已成為當務之急。 Rv2389蛋白是結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB） 復活促進因子（resuscitationpromoting factor，  Rpf）樣蛋白家族的一員，序列分析發(fā)現(xiàn)，它不僅與細菌的增殖有關，還有可能是宿主免疫系統(tǒng)識別的一個靶抗原［2］。 為此，我們在Rv2389原核表達和純化的基礎上，構建了真核表達載體并在CHO（ 中國倉鼠卵巢）細胞中進行表達，同時從其表達水平和基因轉錄兩方面進行鑒定，為其功能研究奠定基礎。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　MTB H37Rv菌株，P815細胞由本室保存；真核表達載體pCDNA3.1（-）由本室保存；含有Rv2389基因的重組質粒pPro EX HTRv2389由本室構建保存；Rv2389蛋白多抗由本實驗室制備；AMV，RNA 酶抑制劑和TRIzol（Promega公司）；限制性內切酶、T4 DNA連接酶和核酸分子質量標準品（寶泰克公司）；質粒提取試劑盒（Omega公司）；梭華soft陽離子聚合物（廈門太陽馬公司）；羊抗鼠熒光抗體（寶信公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1Rv2389基因片段的擴增與測序結核分枝桿菌Rv2389全基因序列的特異性引物序列為：P1：5′gga tcc gcc acc atg acc ccg ggt ttg ctt ac3′，含BamHⅠ酶切位點，起始碼和cozak序列；P2：5′ccg aag ctt atc gtc cct gct ccc cga tga3′，含HindⅢ酶切位點和終止碼。 PCR反應條件：94℃ 40 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)，72℃延伸10 min. 回收PCR產物，用T4連接酶將PCR產物與pGEMTeasy載體連接，轉化E.coli DH5α，隨機挑取5個克隆提取質粒進行雙酶切鑒定，取2個鑒定正確的克隆進行測序［3］。

　　1.2.2重組質粒的構建及鑒定將測序正確的Rv2389基因克隆至真核表達載體pCDNA3.1（-），構建重組質粒pCDNARv2389. 連接轉化、質粒提取均按文獻進行［3］。 以BamHⅠ和HindⅢ酶切pCDNARv2389，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質粒。

　　1.2.3細胞轉染將5×105 個CHO細胞接種于6孔板，細胞數(shù)量達孔底約2/3時進行轉染。 轉染前用不含抗生素的1640培養(yǎng)液洗2次，以0.5 mL 1640培養(yǎng)液重懸細胞。 pCDNARv2389重組質粒10 μL和陽離子聚合物5 μL各用80 μL無血清的1640培養(yǎng)液稀釋，兩者混勻后室溫作用20 min，緩慢加入到細胞中。  培養(yǎng)24 h后收集細胞，同時設正常細胞對照。

　　1.2.4RTPCR檢測mRNA表達收集重組質粒轉染的CHO細胞，2000 r/min離心10 min. 參照Gibco的TRIzol試劑盒說明書提取細胞mRNA. 在上述10 μL mRNA 溶液中，加入1 μL Oligo（dT）12-18引物，70℃水浴5 min后立即置于冰上，加10×buffer 4 μL， MgSO4 4 μL， 10 mmol/L dNTPs 2 μL，RNA inhibitor 0.6 μL，AMV 0.8 μL，H2O 10.4 μL. 混勻，42℃作用1 h，70℃ 15 min終止反應。 PCR反應時加入cDNA第1鏈2 μL，反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸40 s，共進行30個循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸2 min，擴增產物以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

　　1.2.5間接免疫熒光檢測目的基因表達將轉染pCDNARv2389質粒的CHO細胞爬片，用純化的Rv2389融合蛋白制備的免疫血清作為一抗，間接免疫熒光法檢測CHO細胞中融合蛋白的表達［4］。

　　2結果

　　2.1目的基因的擴增、克隆及酶切鑒定用PCR方法從H37Rv中擴增出Rv2389的DNA片段，被順利克隆入pGEMTeasy載體，測序證實所克隆的基因完全正確。 序列分析與GenBank報道的一致（圖1）。

　　M：DL2000 marker；1：PCR產物。

　　圖1Rv2389基因的PCR結果（略）

　　2.2重組質粒的酶切鑒定重組質粒pCDNARv2389被BamHⅠ和HindIII 雙酶切后可得到約475 bp的片段，與預期的大小相一致（圖2）。

　　M：DL2000 marker；  1～3： pCDNARv2389被BamHⅠ和HindⅢ雙酶切。

　　圖2重組質粒的酶切鑒定（略）

　　2.3RTPCR檢測mRNA表達在約475 bp處擴增出特異性基因（圖3），表明pCDNARv2389重組質?？梢栽贑HO細胞中轉錄。

　　M：DL2000 marker；1：  RTPCR產物。

　　圖3重組質粒轉染CHO細胞的RTPCR結果（略）

　　2.4間接免疫熒光檢測目的基因表達轉染細胞在經過間接免疫熒光染色后，陽性細胞有較強的熒光著染，表達蛋白定位于細胞膜上，而對照組細胞沒有著染（圖4）。

　　A：Rv2389融合蛋白在CHO細胞內表達；B：對照。

　　圖4間接免疫熒光測定融合蛋白在CHO細胞中的表達×400（略）

　　3討論

　　Mukamolova GV等［5］研究發(fā)現(xiàn)藤黃微球菌（Micrococcus luteus， M. luteus）可分泌一種Rpf，該因子可刺激該菌休眠體復活和生長，也可促進繁殖體生長，研究證實Rpf作用與真核細胞的細胞因子相似，具有自我刺激作用又稱細菌因子。 同時進一步研究證實該因子也可以刺激其他種類的高（G+C）%的革蘭陽性菌，包括結核分枝桿菌。 結核分枝桿菌全基因序列分析表明，其中Rv1884c；Rv2450c，Rv0867c，Rv1009，Rv2389c和基因與M.luteus菌Rpf基因同源，其中4個基因編碼的蛋白是分泌蛋白，推測結核桿菌這些基因編碼的蛋白可能也具有Rpf作用，但尚無直接證據(jù)［5-6］。 Sassetti等［7］采用大規(guī)模插入突變分析發(fā)現(xiàn)Rpf樣蛋白并不是H37Rv株生長所必需，而且這5種Rpf樣蛋白在功能上有一定的重疊。 因為突變Rv1009基因可明顯減緩MTB的生長速度，提示其在MTB的生長中可能發(fā)揮著較為重要的作用。 以往研究［8］表明，MTB H37Rv株的幾種Rpf樣蛋白與M.luteus的Rpf蛋白一樣，都屬于膜蛋白，因而這些蛋白（或者這些蛋白中的某個或某幾個蛋白）有可能會被宿主的免疫系統(tǒng)所識別，從而有可能作為亞單位疫苗的備選組分。

　　近年來，國外在TB新型疫苗或增強BCG免疫效果方面已作了大量的研究工作，并正在進行大規(guī)模的候選疫苗篩選工作。 由于結核分枝桿菌Rpf家族蛋白不僅可以促進結核休眠菌復活，而且還具有多種生物學活性如自溶素和/或青霉素結合蛋白的功能、細胞學方面的功能等［9］，此外這幾種Rpf樣蛋白與M.luteus的Rpf蛋白一樣，都屬于膜蛋白，因而這些蛋白（或者這些蛋白中的某個或某幾個蛋白）有可能會被宿主的免疫系統(tǒng)所識別，從而有可能作為亞單位疫苗的備選組分。 在本實驗中，我們在Rv2389原核表達和純化的工作基礎上構建了真核表達載體并在CHO細胞中進行表達，同時從其表達水平和基因轉錄兩方面進行鑒定，為其在新型疫苗的應用中奠定了基礎。

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