【摘要】  目的：應用分子生物學技術(shù)，構(gòu)建pIHsp65GM雙順反子真核表達質(zhì)粒，并在真核細胞中表達。 方法：以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組為模板經(jīng)聚合酶鏈反應（PCR）擴增出Hsp65基因，同時從質(zhì)粒pORFhGMCSF中擴增出基因佐劑hGMCSF，分別克隆到真核表達載體pIRES的多克隆位點A（MCSA）和B（MCSB）中，構(gòu)建pIHsp65GM真核表達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染HepG2細胞中表達和檢測。 結(jié)果：酶切鑒定提示插入的基因片段大小分別為1.64 kb和0.47 kb，測序分析表明克隆的Hsp65和hGMCSF序列與GenBank上公布序列完全一致；免疫組織化學方法檢測到表達Hsp65的陽性細胞；ELISA方法檢測到pIHsp65GM轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)上清中hGMCSF的表達，與空載體對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。 結(jié)論：成功構(gòu)建和表達了pIHsp65GM質(zhì)粒，為研制優(yōu)于卡介苗的新型抗結(jié)核病DNA疫苗奠定基礎。

　　【關(guān)鍵詞】  結(jié)核分枝桿菌；熱休克蛋白65；人粒巨噬細胞集落刺激因子；雙順反子；基因佐劑

　　0引言

　　卡介苗（bacille calmetteguerin， BCG）是已被廣泛應用于預防結(jié)核?。╰uberculosis， TB）的減毒活疫苗。 由于結(jié)核DNA疫苗的制備簡便、免疫效果好，目前已經(jīng)成為TB的熱門侯選疫苗之一［1］。 結(jié)核桿菌熱休克蛋白65KD基因（heat shock protein 65KD， Hsp65）是研究最早的結(jié)核抗原之一，可以在動物體內(nèi)對結(jié)核分枝桿菌的感染產(chǎn)生強烈的保護性免疫反應［2］。粒細胞吞噬細胞集落刺激因子（granulocytemacrophage  colonystimulating factor， GMCSF）作為良好的基因佐劑，可以利用其上調(diào)機體免疫水平的作用增強DNA疫苗的效能［3-4］。 雖然Hsp65抗原和GMCSF分別在感染免疫中的作用已經(jīng)被研究證實有效，但對人GMCSF協(xié)同Hsp65抗原在結(jié)核桿菌感染中的免疫應答特點和保護力尚不清楚［5］。 我們將兩者同時克隆到同一載體上，構(gòu)建含結(jié)核桿菌Hsp65和基因佐劑hGMCSF的雙順反子真核質(zhì)粒，旨在為進一步了解結(jié)核DNA疫苗的免疫效果奠定基礎。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組，大腸桿菌DH5α，載體pIRES和質(zhì)粒pORFhGMCSF（暨南大學醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室提供）；Ex Taq DNA聚合酶，T4 DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶Nhe I，EcoR I， Xba I和Not I，DL1 kb marker，質(zhì)粒提取試劑盒，DNA凝膠回收純化試劑盒（大連寶生物公司）；兩對PCR引物、重組質(zhì)粒上目的基因的序列測定由上海生工生物工程公司完成； Transmaster轉(zhuǎn)染試劑（廣州博理生物科技公司）；即用型免疫組化Biotin SPHRP試劑盒，DAB酶底物顯色試劑盒（北京鼎國生物科技公司）；鼠抗人Hsp65蛋白單克隆抗體和人hGMCSF蛋白ELISA檢測試劑盒（深圳市晶美生物科技公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1目的基因

　　Hsp65和hGMCSF的PCR擴增參照GenBank上結(jié)核分枝桿菌H37Rv株Hsp65基因CDS序列（NCBI登陸號：M15467）分別設計引物進行PCR擴增。

　　1.2.2pIHsp65真核載體的構(gòu)建與鑒定

　　將Hsp65的PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收純化后與載體pIRES，同時用Nhe I和EcoR I雙酶切，酶切后進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并經(jīng)過凝膠回收純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物，將兩者酶切純化的產(chǎn)物按照3∶1的摩爾比混合，用T4 DNA連接酶連接24 h.轉(zhuǎn)化用低溫CaCl2制備的E.coli DH5α感受態(tài)細菌，然后涂布于含氨芐青霉素50 μg/mL的LB固體培養(yǎng)基中。次日，隨機挑取10個單菌落，分別接種于3 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。先取少量菌液煮沸作為模板進行菌落PCR檢測是否有Hsp65的存在，將菌落PCR篩選呈陽性的菌落用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA.將提取的質(zhì)粒DNA用Nhe I和EcoR I雙酶切，進行電泳檢測，以DL1 kb  marker為分子量參照， 將篩選出的陽性克隆產(chǎn)物的菌液進行測序鑒定。 測序采用Sanger雙脫氧鏈終止法， 對插入序列的兩端進行測定， 測序工作由上海生物工程公司完成。

　　1.2.3pIHsp65GM真核表達

　　質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定同構(gòu)建pIHsp65載體方法一樣，將hGMCSF的PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收純化后與載體pIHsp65同時用Xba I 和Not I 雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化后，將兩者酶切純化的產(chǎn)物按照3∶1的摩爾比混合，用T4 DNA連接酶連接24 h，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌E.coli DH5α，涂布于含氨芐青霉素50 μg/mL的LB固體培養(yǎng)基中。次日，隨機挑取10個單菌落，分別接種于3 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。將菌落PCR篩選呈陽性的菌落用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA.將提取的質(zhì)粒DNA用Xba I 和Not I雙酶切，進行電泳檢測，以DL1 kb marker為分子量參照，將篩選出的陽性克隆產(chǎn)物的菌液進行測序鑒定。

　　1.2.4細胞轉(zhuǎn)染

　　取對數(shù)生長期的HepG2細胞接種在12孔板內(nèi)， 待細胞生長至70%～80 %時， 加入陽離子多聚體轉(zhuǎn)染試劑Transmaster和質(zhì)粒pIHsp65GM的混合物。饑餓培養(yǎng)1 h，加入含100 mL/L小牛血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，檢測Hsp65和hGMCSF蛋白的表達。

　　1.2.5Hsp65蛋白表達的免疫組化檢測

　　采用未轉(zhuǎn)染細胞為空白對照和轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒pIRES的細胞為陰性對照，將空質(zhì)粒pIRES和重組質(zhì)粒pIHsp65GM轉(zhuǎn)染HepG2細胞48 h，去除培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖鹽水PBS沖洗。經(jīng)40 g/L的多聚甲醛固定后，依次滴加過氧化酶阻斷劑，正常動物非免疫血清，1∶1000鼠抗人Hsp65蛋白抗體，生物素標記二抗和鏈霉素抗生物素蛋白。最后加入新鮮配制的DAB工作液染色，顯微鏡下觀察結(jié)果，Hsp65蛋白的表達以細胞質(zhì)染呈棕黃色者為陽性。

　　1.2.6ELISA法檢測

　　hGMCSF蛋白表達水平分別收集pIRES和質(zhì)粒pIHsp65GM轉(zhuǎn)染24 h和48 h的HepG2細胞的細胞培養(yǎng)的上清液，采用ELISA雙抗體夾心法檢測hGMCSF蛋白的表達量，按照試劑盒說明進行操作。用酶標儀在吸光度A450 nm下測定樣品和試劑盒提供的標準品的A值。根據(jù)標準品所測A值繪制的蛋白濃度與A值相關(guān)標準曲線計算各樣品中hGMCSF蛋白的含量（以空白孔調(diào)零）。

　　統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 13.0軟件包進行分析，組間比較采用兩樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

　　2結(jié)果

　　2.1Hsp65和hGMCSF基因PCR擴增產(chǎn)物電泳分析

　　瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物分別為1.64 kb和0.47 kb的特異性片段，與預期Hsp65和hGMCSF基因大小相符（圖1）。

　　2.2重組質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶消化鑒定

　　質(zhì)粒pIHsp65經(jīng)Nhe I和EcoR I雙酶切后，電泳可見大小約6.1 kb與1.64 kb兩片段，與載體pIRES經(jīng)Nhe I和EcoR I雙酶切產(chǎn)物和Hsp65基因PCR產(chǎn)物的2條特異性條帶對比，大小相符（圖2A）。重組質(zhì)粒pIHsp65GM經(jīng)Xba I 和Not I雙酶切后，電泳可見大小約為7.74 kb與0.47 kb兩片段，與質(zhì)粒pIHsp65經(jīng)Xba I和Not I雙酶切產(chǎn)物和hGMCSF基因PCR產(chǎn)物的2條特異性條帶對比，大小相符（圖2B）。

　　2.3序列分析鑒定

　　對質(zhì)粒pIHsp65上的多克隆位點A（multiple cloning sites A，MCSA）內(nèi)的DNA序列進行序列分析鑒定，結(jié)果與結(jié)核分支桿菌H37Rv株的Hsp 65的基因序列完全相同。對質(zhì)粒pIHsp65GM上的多克隆位點B（multiple cloning sites B， MCSB）內(nèi)的DNA序列進行序列分析鑒定， 結(jié)果與hGMCSF的基因序列完全相同。

　　2.4Hsp65蛋白在HepG2細胞中的表達

　　顯微鏡下觀察，與未轉(zhuǎn)染細胞的空白對照和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pIRES細胞的陰性對照對比，pIHsp65GM轉(zhuǎn)染的部分HepG2細胞中胞質(zhì)染呈棕黃色，表明Hsp65表達呈陽性（圖3）。

　　2.5ELISA檢測

　　pIRES對照組在轉(zhuǎn)染24和48 h時細胞上清液hGMCSF的表達量分別為（1.371±0.083） pg/mL和（1.782 ±0.127） pg/mL （n=3），而pIHsp65GM在轉(zhuǎn)染24和48 h時細胞上清液hGMCSF的表達量分別為（271.103 ±4.731） pg/mL和（253.124±3.943）pg/mL；pIHsp65GM轉(zhuǎn)染組在轉(zhuǎn)染24和48 h時hGMCSF的表達量與pIRES對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

　　3討論

　　近年來，對結(jié)核研究最多的抗原主要有Hsp65，Ag85B， ESAT6和MPT64等［6-7］。其中Hsp65具有免疫優(yōu)勢抗原的特性，能誘導和增強機體的體液免疫和細胞免疫的發(fā)生，并可激活γδT細胞，分泌高水平的IFNγ和殺傷感染的細胞，是人體感染結(jié)核桿菌以后免疫系統(tǒng)的主要靶抗原，是T細胞攻擊的主要對象［8］。 由于僅含有單抗原基因的DNA疫苗并不足以引發(fā)良好的免疫效果，還需要結(jié)合其他的手段如基因佐劑，特別是將細胞因子與DNA疫苗共表達才能產(chǎn)生更強的免疫保護力。 GMCSF作為DNA疫苗的免疫佐劑，能夠調(diào)節(jié)樹突狀細胞的分化和成熟，以及MHC和共刺激分子的表達水平，并且通過調(diào)節(jié)抗原提呈細胞尤其是樹突狀細胞的數(shù)量和功能來調(diào)節(jié)免疫應答的強度。有研究認為將GMCSF作為佐劑與基因疫苗共同免疫小鼠結(jié)果比單獨應用基因疫苗產(chǎn)生更強烈的細胞免疫應答并可提供更強的免疫保護力［3-5］。本實驗采用載體pIRES為雙順反子真核表達質(zhì)粒，在上下游克隆位點之間的序列為內(nèi)部核糖體進入位點， 此段序列在轉(zhuǎn)錄后能夠自動斷裂， 使上下游克隆位點插入的基因能夠獨立高效的表達，從而避免了融合表達蛋白活性低下問題， 為兩種蛋白表達、動物實驗和結(jié)核疫苗研制提供較大方便。

　　與以往結(jié)核DNA疫苗的研究比較，本實驗具有以下特點：①實現(xiàn)了目的基因與細胞因子基因在同一載體上共同表達。如果將DNA疫苗與編碼GMCSF的質(zhì)?；旌献⑸鋾NA疫苗的免疫效果產(chǎn)生干擾作用；若將GMCSF與目的基因共同克隆到一個載體中，由于兩個基因具有相同的局部微環(huán)境，往往可以獲得較好的免疫效果［9］。②本研究使用雙順反子真核表達載體pIRES，將兩個基因分別克隆到兩個多克隆位點，兩者各自表達，不相互影響蛋白表達的空間結(jié)構(gòu)。因為表達為融合產(chǎn)物的DNA疫苗可能破壞抗原的三維結(jié)構(gòu)，對抗體的生成產(chǎn)生負面影響［10］。

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