間接ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）是一種常用的免疫測定方法，主要用于檢測血清或其他體液中的抗體。其基本原理是利用固相載體上包被的抗原與待測樣本中相應(yīng)的特異性抗體結(jié)合，再通過標(biāo)記有酶的二抗來放大信號(hào)，最后通過顯色反應(yīng)來定性或定量地分析目標(biāo)抗體的存在與否及其含量。間接ELISA檢測步驟通常包括以下幾個(gè)環(huán)節(jié)：
1. 包被：將已知抗原稀釋至適宜濃度后加入到微孔板中，在37℃溫育一定時(shí)間（如2小時(shí)），使抗原吸附于微孔表面形成固相化抗原。
2. 封閉：用含有蛋白的緩沖液（如5%脫脂奶粉溶液）覆蓋所有未被抗原占據(jù)的位置，以減少非特異性結(jié)合。通常在37℃下溫育1-2小時(shí)。
3. 加樣：將待測樣品加入到已封閉處理過的微孔板中，于37℃孵育一段時(shí)間（如1小時(shí)），讓樣本中的抗體與固相化抗原發(fā)生特異性結(jié)合。
4. 洗滌：使用PBS或TBS緩沖液清洗微孔板以去除未結(jié)合的物質(zhì)及非特異吸附物，一般需要洗滌3-5次。
5. 加入酶標(biāo)二抗：向每個(gè)孔中加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)記二抗（如HRP標(biāo)記羊抗人IgG），37℃孵育1小時(shí)。此步驟中的二抗能夠與樣本中存在的特異性抗體結(jié)合，并帶有可以催化底物顯色的酶。
6. 再次洗滌：重復(fù)第4步的操作，徹底清除未結(jié)合的酶標(biāo)二抗。
7. 顯色反應(yīng)：向每個(gè)孔中加入適量的底物溶液（如TMB），37℃避光孵育一定時(shí)間后觀察顏色變化?？贵w-酶復(fù)合體催化底物產(chǎn)生顏色變化，通過比色法測定吸光度值來判斷樣品中目標(biāo)抗體的存在及濃度。
8. 終止反應(yīng)：向每個(gè)孔加入終止液（如2M硫酸）以停止顯色過程，并記錄各孔的OD值。
9. 數(shù)據(jù)分析：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣本中的抗體濃度。通常會(huì)設(shè)立陰性對(duì)照、陽性對(duì)照以及空白對(duì)照，以便校正和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性和準(zhǔn)確性。

以上即為間接